一个大鼠ELISA试剂盒可以检测几个样品,步骤以及

作者: 客户案例  发布:2019-12-18

其基本方法是将已知的抗原或者抗体吸附在固相载体表面,并保持其免疫活性。然后抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,elisa试剂盒又保留酶的活性。在测定时,把受检标本和酶标抗原或抗体按不同与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。 大家看到此过程中有一个“固相载体”,那就是酶标板。酶标板是一种配合在酶标仪上,用来做酶联免疫实验的耗材。虽然它看上去只是一块普通的有孔的塑料板,elisa试剂盒但是在酶免疫测定中却是一个不可缺少的部分。所以可以知道,酶标板是一个不可缺少的中介,没有了这个中介,整个实验就无法进行操作。换一句话说,只要你用酶标仪做酶联免疫实验,就必然会用到酶标板。或不易得到足够的纯化抗原时,可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多,结合在固相上的酶标抗体愈少,因此阳性反应呈色浅于阴性反应。 如抗原为高纯度的,可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质,直接包被不易成功,可采用捕获包被法,即先包被与固相抗原相应的抗体,然后加入抗原,形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质,然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式,可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合,抗hbelisa试剂盒一般采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合,洗涤后再加入酶标抗体,与结合在固相上的抗原反应。抗hbe的检测一般采用此法。

ELISA试剂盒实验原理

一个大鼠ELISA试剂盒检测几个样品?

酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)原理

大鼠ELISA试剂盒的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。大鼠ELISA试剂盒在测定时,受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体,也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,间接地放大了免疫反应的结果,使测定方法达到很高的敏感度。ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体。

1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent 

然而,影响大鼠ELISA试剂盒试验结果的因素很多,故加强各个环节的质量保证才能充分发挥其方法学的优点。

assay,ELISA)用于IgG定量测定的文章,使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成

48T可做42个样本加6个标准点

液体标本中微量物质的测定方法。

96T可做90个样本加6个标准点大鼠ELISA试剂盒的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。大鼠ELISA试剂盒在测定时,受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体,也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,间接地放大了免疫反应的结果,使测定方法达到很高的敏感度。ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体。

ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗

然而,影响大鼠ELISA试剂盒试验结果的因素很多,故加强各个环节的质量保证才能充分发挥其方法学的优点。

体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。在测定

48T可做42个样本加6个标准点

时,受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使

96T可做90个样本加6个标准点

固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体,也

通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入

酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故

可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。

由于酶的催化频率很高,故可极大地地放大反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度

类型及步骤

ELISA的主要常用类型及步骤

  1. 间接法测抗体

间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体(二抗)以检测与固相抗原结合的

受检抗体,故称为间接法。操作步骤如下:

1)将特异性抗原与固相载体联结,形成固相抗原,洗涤除去未结合的抗原及杂质。

2)加稀释的样本,保温反应。样本中的特异抗体与固相抗原结合,形成固相抗原抗体复合物。

经洗涤后,固相载体上只留下特异性抗体,样本中的其他成份在洗涤过程中被洗去。

3)加酶标抗抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗抗体结合,从而间接地标记上酶。洗涤后

,固相载体上的酶量与样本中受检抗体的量正相关。

4)加底物显色。

2.竞争法测抗原

小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点,因此不能用双抗体夹心法进行测定

,可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标

本中抗原量含量愈多,结合在固相上的酶标抗原愈少,最后的显色也愈浅。小分子激素、药物

等ELISA测定多用此法。

如何选择合适的阳性对照?

阳性对照的基本组成应该尽量与检测样本的组成一致,一般阳性对照多以含蛋白保护剂的缓冲

液为基质,加入一定量的待检物质。比如,以人血清为标本的测定,阳性对照多用确定的病人

血清或者以复钙人血浆为原料加入一定量标准品。

如何选择合适的阴性对照?

阴性对照的基本组成也应该尽量与检测样本的组成一致,最好先行检测确定其中不含待检物质

。比如,检测人血清标本时,阴性对照应该选择正常人血清;检测免疫动物血清中抗体效价时,

阴性对照应该选择该动物的免疫前血清。

如何选择最优化的包被条件?

1.包被抗原的选择

包被抗原可分为天然蛋白、重组蛋白和小分子抗原三大类。天然蛋白需经纯化才能用直接吸附

法包被,对于含杂质较多的抗原可以采用间接捕获法包被(先用能够与目的抗原反应的物质如抗

体直接吸附在酶标板上,再通过特异性反应使抗原固相化)。经纯化的重组蛋白一般皆可直接包

板。小分子抗原比如多肽以及一些小分子有机化合物,由于分子量太小,往往难于直接吸附在

酶标板上,一般都先使其与无关蛋白质如BSA等偶联,偶联物吸附于固相载体上。

2.包被液的选择

一般常用的是pH9.6的碳酸盐缓冲液,如果包被的抗原在碱性条件下不稳定的话,也可以使用

pH7.2的磷酸盐缓冲液。

3.包被温度的选择

通常是4-8度条件下过一夜或者37度保温2小时,我们强烈建议4-8度条件下包被,有利于蛋白

活性的保持。

4.包被浓度的选择

包被的最适浓度随固相载体和包被物的性质变化,一般蛋白质的包被浓度为1-5ug/ml,要明确

针对特定包被抗原的最适包被浓度需要通过实验来确定。

包板后需要封闭吗?应该选择什么样的封闭体系?

封闭是否必要,取决于ELISA的模式及具体的实验条件。一般说来,双抗体夹心法,只要酶标

记物是高活性的,操作时洗涤彻底,不经封闭也可得到满意的结果。而在间接法测定中,封闭

一般是必不可少的。

常用的封闭剂有0.05%-0.5%的BSA、10%的小牛血清、1%明胶、5%的脱脂奶粉,AbMART推荐使

用5%脱脂奶粉,价廉而且封闭能力强,不过5%脱脂奶粉只适合短期内使用,不宜长期保存,所

以试剂盒中较少使用。

如何正确使用酶结合物?

1.酶结合物的稀释液

在稀释液中常加入高浓度的无关蛋白质(例如1%BSA或5%脱脂奶粉),通过竞争抑制酶结合物在

固相载体上的非特异性吸附。一般还加入能够抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性

剂,如吐温20(0.05%的浓度较为适宜)。

2.正确稀释酶结合物

酶结合物的合适工作浓度需要通过预实验来确定,浓度过高易导致本底偏高,浓度过低则会导

致阳性信号的减弱。

酶结合物最好在使用前稀释,稀释后的酶结合物不宜长期保存,因为低浓度的酶结合物极易失

活。

问题/可能的原因/解决方法

1、问题:阴性对照产生了阳性的结果

  可能的原因:试剂或者耗材污染

  解决方法:更换试剂,使用一次性耗材

2、问题:洗板出现问题

  解决方法:更换更强配方的洗涤液,增加洗板次数,延长洗板时间

  (如果是在双抗体夹心法中出现,有可能是包被抗体与二抗间有交叉反应,则要更换包被抗

体或二抗)

3、问题:二抗产生了非特异性吸附

  解决方法:减少二抗使用量,缩短二抗反应时间

4、问题:显色液不新鲜

  解决方法:使用现配的显色液

5、问题:反应信号偏低

  可能的原因:包被条件不合适

  解决方法:提高包板浓度,延长包板时间

6、问题:梯度稀释做ELISA时产生跳孔现象

  可能的原因:酶标板叠放导致传热不均匀,各孔反应温度有差异

  解决方法:尽量避免酶标板叠放在一起

7、问题:移液器稀释时未能保持连续性

  解决方法:定期校准移液器,确保移液器的正确使用

本文由金冠彩票发布于客户案例,转载请注明出处:一个大鼠ELISA试剂盒可以检测几个样品,步骤以及

关键词: